Colorazione Kinyoun: fondazione e tecniche

La colorazione di Kinyoun è una tecnica di colorazione usata per macchiare i batteri e i parassiti resistenti agli acidi. È nato dalla modifica della colorazione di Ziehl-Neelsen; Entrambe le tecniche sono interpretate allo stesso modo ma differiscono in due elementi: nella preparazione del reagente principale e in quanto la tecnica Kinyoun non utilizza il calore.

Per questo motivo è noto anche come Ziehl-Neelsen modificato a freddo o colorazione a freddo Kinyoun. È indicato per la colorazione di Mycobacterium tuberculosis, Micobacterium leprae, micobatteri atipici, Nocardias sp, Cryptosporidium parvum, Cryptosporidium meleagridis, Cryptosporidium felis, Cryptosporidium muris e Cyclosporas cayetanensis .

Vale la pena notare che le Nocardie si macchiano debolmente con questa tecnica poiché sono parzialmente alcol resistenti agli acidi, quindi per questo genere c'è una modifica della metodologia.

A sua volta, la tecnica del freddo Kinyoun è stata combinata con la tecnica tricromatica modificata da Didier per la rilevazione di coccidi ( Criptosporidium parvum e Isospora belli ) e spore di microsporidi ( Enterocytozoon bieneusi e Encephalitozoon intestinalis ).

fondazione

Il principale reagente di colorazione è carbol fuchsin o fenicaine fuchsin, che ha la proprietà di legarsi agli acidi carbolici all'interno della parete cellulare cerosa, ricchi di lipidi (acidi micolici) di micobatteri e alcuni parassiti.

Quella unione non viene neutralizzata dalla decolorazione acida; pertanto, i microrganismi sono definiti come alcol resistente agli acidi.

A differenza della tecnica di Ziehl-Neelsen - che fissa il colorante attraverso il calore - nella tecnica di Kinyoun questo passaggio non è necessario, poiché la soluzione di fucsina fenolica preparata per questa tecnica contiene un'alta concentrazione di fenolo.

Il fenolo scioglie il materiale lipidico della parete cellulare, che consente l'ingresso del colorante carbol fuchsin. Dopo che la tintura penetra, rimane fissa nonostante il lavaggio con acido alcolico.

In questo modo i microrganismi resistenti agli acidi assumono il caratteristico colore rosso, mentre tutto ciò che non è alcol resistente agli acidi diventa scolorito e colorato di blu.

tecnica

materiale

- Fuchsin fenolico modificato.

- Acido alcolico.

- Blu di metilene.

Preparazione del fucsin fenicated di Kinyoun

- Fuchsin di base: 4 gr.

- Fenolo: 8 ml.

- Alcool (95%): 20 ml.

- Acqua distillata: 100 ml.

Il fucsin basico nell'alcool deve essere sciolto lentamente, mescolando costantemente. Successivamente, il fenolo cristallizzato viene fuso in un bagno d'acqua a 56 ° C. Una volta sciolto, 8 ml vengono aggiunti alla soluzione di fucsina preparata sopra.

Preparazione di acido alcolico

- Acido cloridrico concentrato: 3 ml.

- Etanolo (95%): 97 ml.

Deve essere misurato, unito e misto.

Preparazione della tintura a contrasto blu di metilene

- Blu di metilene: 0, 3 g.

- Acqua distillata: 100 ml.

Pesa e si dissolve.

Tecnica delle macchie di Kinyoun

1- Preparare uno striscio direttamente dal campione, che può essere espettorato, liquido polmonare, sedimento urinario, liquido cerebrospinale o feci, tra gli altri; o da una sospensione di microrganismi ottenuti da colonie pure coltivate in terreni di coltura primaria.

2- Fissare lo striscio con il calore.

3- Posizionare lo striscio sul ponte colorante e coprire con il reattivo fenolico di Kinyoun preparato. Lascia riposare per 3 o 5 minuti.

4- Lavare con acqua distillata.

5- Bleach con alcool acido per 3 minuti e lavare di nuovo con acqua distillata.

6 - Decolorare nuovamente con alcool acido per 1 o 2 minuti fino a quando non viene trascinato più colorante.

7- Lavare con acqua distillata e lasciare scaricare, posizionando il vetrino in posizione verticale.

8- Coprire la preparazione con blu di metilene e lasciare per 4 minuti.

9- Lavare con acqua distillata e lasciare asciugare all'aria.

10- Esaminare a 40X e poi a 100X.

Se si desidera migliorare e accelerare la colorazione dei microrganismi acido-veloci, aggiungere 1 goccia di un agente umettante (come il tergitolo n. 7) a 30 o 40 ml di fucsina di acido fenico Kinyoun.

Alcuni laboratori cambiano la tintura a contrasto blu di metilene per il verde brillante o l'acido picrico; il primo dà un colore verde allo sfondo e il secondo genera un colore giallo.

Tecnica Kinyoun speciale per Nocardias

Per migliorare la colorazione dei batteri Nocardia, viene utilizzata una modifica della colorazione Kinyoun. La tecnica è la seguente:

1- Coprire lo striscio con fucsina fenolica Kinyoun per 3 minuti.

2- Lavare con acqua distillata.

3- Arrossire brevemente con alcol acido al 3% fino a quando non viene trascinato più colorante.

4- Lavare di nuovo con acqua distillata.

5- Coprire la preparazione con blu di metilene e lasciare agire per 30 secondi.

6- Lavare con acqua distillata e lasciare asciugare all'aria.

Tecnica combinata di fucsina fenolica e tricromica modificata da Didier

Questa tecnica è raccomandata per l'analisi di campioni di feci alla ricerca di coccidi e spore di microsporidium sp allo stesso tempo. La procedura da seguire è la seguente:

1- Coprire lo striscio con fucsina fenolica Kinyoun per 10 minuti.

2- Rimuovere la tintura e lavare con acqua distillata.

3- Bleach per 30 secondi con acido cloridrico alcolico.

4- Lavare di nuovo con acqua distillata.

5- Coprire lo striscio con soluzione tricromatica per 30 minuti a 37 ° C.

6- Lavare con acqua distillata.

7- Decolorare per 10 secondi con acido acetico alcolico.

8- Lavare lo striscio per 30 secondi usando etanolo al 95%.

Controllo di qualità

Come controllo positivo, gli strisci vengono preparati con ceppi di Mycobacterium tuberculosis e colorati con i reagenti preparati per verificare che i batteri assumano il colore giusto (rosso-fucsia).

I controlli negativi possono essere utilizzati anche preparando gli strisci con qualsiasi ceppo che non sia resistente agli acidi grassi, verificando quindi che l'intero campione abbia il colore del contrasto.

Tecnica di Kinyoun rispetto alla tecnica di Ziehl -Neelsen

La tecnica di Kinyoun è più semplice perché elimina la fase di riscaldamento, ma il suo principale vantaggio è che impedisce l'emissione di vapori, altamente tossici e che causano il cancro a lungo termine. Pertanto, la colorazione di Kinyoun è più sicura per il personale addetto alla colorazione.

È importante tenere presente che è necessario fare attenzione che i reagenti non entrino in contatto diretto con la pelle, poiché sono corrosivi e la candeggina è infiammabile.

Riguardo agli svantaggi, uno striscio negativo non indica necessariamente che il microrganismo non è presente. Inoltre, la presenza di detriti cellulari può causare falsi positivi, il che genera confusione nella diagnosi.

riferimento

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