Agar EMB: fondazione, preparazione e uso

L'agar EMB è un terreno di coltura solido selettivo e differenziale utilizzato per l'isolamento dei bacilli Gram-negativi, principalmente dalle Enterobacteriaceae della famiglia e altri bacilli Gram negativi non impegnativi. È anche conosciuto con l'acronimo EAM, che significa blu eosina-metilene.

Questo mezzo è stato creato da Holt-Harris e Teague nel 1916. Contiene peptone, lattosio, saccarosio, fosfato dipotassico, agar, eosina, blu di metilene e acqua. È molto simile all'agar MacConkey, specialmente se viene utilizzato l'agar EMB modificato da Levine, che non contiene saccarosio.

Infatti, ogni laboratorio decide se funziona con l'uno o l'altro, poiché adempiono la stessa funzione, sebbene biochimicamente essi siano diversi.

Presenta anche lo stesso inconveniente del classico agar MacConkey in termini di produzione di sciami del genere Proteus. Pertanto, per evitare questo fenomeno, la concentrazione di agar può essere aumentata fino al 5%.

fondazione

selettivo

L'agar EMB è sottilmente selettivo perché contiene i coloranti anilinici (eosina e blu di metilene), che agiscono come inibitori, prevenendo la crescita della maggior parte dei batteri Gram-positivi e di alcuni esigenti bacilli Gram-negativi.

Tuttavia, questo agar presenta lo svantaggio che alcuni batteri Gram-positivi possono resistere alla presenza delle sostanze inibitorie e crescere come colonie piccole, incolori, puntiformi, come Enterococcus faecalis e alcuni Staphylococcus .

È inoltre possibile coltivare alcuni lieviti, come il complesso Candida albicans, che darà colonie rosa molto piccole. Incluse, le clamidospore possono essere sviluppate da questo lievito se il campione viene seminato per profondità.

differenziale

D'altra parte, l'agar EMB è anche un mezzo differenziale, poiché questi coloranti insieme (eosina e blu di metilene) hanno la proprietà di formare un precipitato a pH acido, quindi servono come indicatori della sua produzione.

Pertanto, i batteri del lattosio o saccarosio debolmente fermentanti producono colonie viola in 24-48 ore. Ad esempio i generi Klebsiella, Enterobacter e Serratia.

Quei batteri che fermentano fortemente il lattosio, come l' Escherichia coli, o il saccarosio, come Yersinia enterocolitica o Proteus penneri, formano un precipitato nero verdastro che conferisce una caratteristica lucentezza metallica a queste specie.

Va notato che se si utilizza il medium leve EMB (senza saccarosio), Yersinia enterocolitica e Proteus penneri produrranno colonie chiare.

I batteri che non fermentano il lattosio o il saccarosio sono nutriti dalla presenza di peptoni, che forniscono gli amminoacidi e l'azoto necessari per lo sviluppo batterico e producono colonie chiare. Ad esempio, i generi Salmonella e Shigella, tra gli altri.

Allo stesso modo, è importante notare che il genere Acinetobacter può presentare colonie di lavanda blu, anche se non è un fermentatore di lattosio, né saccarosio, ma hanno la proprietà di fissare blu di metilene nella sua parete cellulare. Questo può accadere anche con altri batteri ossidanti.

preparazione

Il mezzo disidratato originale è beige chiaro.

Per preparare questo terreno di coltura, 36 grammi del mezzo disidratato devono essere pesati e sospesi in un flaconcino contenente un litro di acqua distillata.

Dopo aver lasciato la miscela per 5 minuti a riposo, portare la fiola a una fonte di calore, mescolando vigorosamente e costantemente fino a quando non bolle e si dissolve completamente.

Successivamente, il terreno di coltura già disciolto deve essere sterilizzato usando l'autoclave a 121 ° C per 15 minuti.

Alla fine del tempo, viene rimosso dall'autoclave e lasciato riposare brevemente. Quindi viene servito anche caldo (45 - 50 ° C) tra 15 e 20 ml di agar in ciascuna capsula di Petri sterile. Il mezzo dovrebbe essere blu tornasole.

Dopo averlo servito, le piastre vengono lasciate leggermente scoperte fino a quando l'agar non si raffredda. Quindi sono coperti e lasciati solidificare completamente. Successivamente vengono ordinati in un supporto per targa invertito e conservati in frigorifero (8 ° C) fino al momento dell'uso.

Questa procedura viene eseguita preferibilmente in una cappa a flusso laminare o davanti al bruciatore Bunsen per evitare la contaminazione.

È importante tenere presente che ogni casa commerciale indicherà l'importo da pesare per preparare il mezzo di coltura.

Il pH finale del mezzo dovrebbe essere 7, 2 ± 0, 2

applicazioni

Questo terreno è usato per seminare urine e feci o qualsiasi tipo di campione clinico, specialmente se si sospetta la presenza di bacilli Gram negativi non impegnativi, come i bacilli appartenenti alle Enterobacteriaceae della famiglia, che cresce molto bene in questo terreno.

I batteri enteropatogeni dei generi Shigella e Salmonella si distinguono per le loro colonie incolori o leggermente ambrate.

Altri bacilli di lattosio non fermentanti crescono, come Aeromonas, Pseudomonas, Acinetobacter, tra gli altri.

Allo stesso modo, questo mezzo è molto utile nell'analisi microbiologica del cibo e dell'acqua, in quanto è ideale per la completa fase di conferma della determinazione dei coliformi, cioè per confermare la presenza di E. coli da brodi torbidi CE, da della tecnica del numero più probabile (NMP).

Controllo di qualità

Per verificare che il terreno di coltura appena preparato funzioni bene, i ceppi di controllo possono essere piantati per osservare le caratteristiche delle colonie e verificare che si conformino come previsto.

Per questo, possono essere utilizzati ceppi ATCC o ceppi ben identificati di E. coli, Enterobacter aerogenes, Klebsiella sp, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Pseudomonas aeruginosa e alcuni batteri Gram-positivi, come S. aureus .

Si prevede che E. coli genererà colonie nero-bluastre ben sviluppate con una lucentezza metallica verde. Considerando che, Enterobacter aerogenes e Klebsiella sp devono dare colonie mucose blu-nero ben sviluppate.

D'altra parte, Salmonella typhimurium e Shigella flexneri, devono sviluppare colonie grandi, incolori o con un leggero colore ambrato.

Infine, il genere Pseudomonas aeruginosa cresce come colonie incolori di dimensioni irregolari, mentre i batteri Gram-positivi dovrebbero essere totalmente inibiti o crescere con parsimonia con colonie molto piccole.

Considerazioni finali

A volte la sterilizzazione causa la riduzione del blu di metilene, osservando un mezzo arancione. Affinché il blu di metilene si ossidi e il colore viola si ripristini, deve essere miscelato delicatamente fino a quando il colore non si riprende.

Inoltre, dopo la sterilizzazione il colorante può precipitare, quindi deve essere miscelato bene prima di servire le piastre di Petri.