Proteinasi K: caratteristiche, attività enzimatica e applicazioni
La proteinasi K è un enzima che appartiene al gruppo delle proteasi di serina, cioè ha nel suo centro catalitico attivo un amminoacido serina e ha la funzione di rompere i legami peptidici per idrolisi. Questo enzima, a sua volta, appartiene alla famiglia delle proteine subtilisine (peptidasi S8).
La proteinasi K ha un peso molecolare (MW) di 28.900 dalton ed è stata isolata per la prima volta nel 1974 da estratti del fungo Engyodontium album, precedentemente noto come album Tritirachium Limber.
Presenta un'elevata capacità proteolitica, dimostrata in grado di degradare la cheratina presente nei capelli. La parola cheratina in inglese è scritta "cheratina", quindi è stata chiamata "proteinasi K".
A causa della sua elevata capacità di scindere le proteine native, questo enzima è utile in varie tecniche di biologia molecolare. Viene principalmente utilizzato per isolare e preparare acidi nucleici ad alto peso molecolare (MW).
La proteinasi K agisce rilasciando il DNA nucleare, mentre distrugge le proteine e inattiva le RNasi e le DNasi, cioè elimina le nucleasi nelle preparazioni di DNA e RNA.
D'altra parte, è stato visto che la proteinasi K può idrolizzare alcune proteine native denaturate, che ha suscitato l'interesse dei ricercatori per il suo uso nello studio delle proteine prioniche (PrP C).
Tuttavia, nonostante la sua elevata capacità proteolitica, esistono proteine resistenti all'azione della proteinasi K. Tra di esse vi sono alcune proteine anomale chiamate prioni (PrP Sc), associate a encefalopatie spongiformi trasmissibili.
Caratteristiche della proteinasi K
La proteinasi K ha una struttura terziaria formata da tre strati, con un foglio β di sette catene intervallate da due strati di eliche. Poiché appartiene alla famiglia delle peptidasi S8, è caratterizzato dall'avere una triade catalitica nel suo sito attivo, il cui ordine sequenziale è (Asp, His e Ser), che li differenzia dalle altre famiglie di peptidasi.
Questo enzima dal gruppo delle proteasi di serina è caratterizzato dall'idrolisi dei legami peptidici vicino al gruppo carbossilico degli amminoacidi alifatici e aromatici.
D'altra parte, è in grado di agire in presenza di determinate sostanze corrosive, come sodio dodecil solfato (SDS), Tris-HCL e EDTA, che sono utilizzate per aiutare la denaturazione delle proteine, facendole perdere la loro struttura nativa.
Questo è un passo preliminare nella preparazione delle proteine per la tecnica dell'elettroforesi. L'intervallo di pH a cui agisce la proteinasi K è piuttosto ampio (da 2, 0 a 12, 0), con un pH ottimale tra 7, 5 e 12, 0 e il suo punto isoelettrico è 8, 9. Come si può vedere, è attivo contro una gamma molto ampia di pH.
Un'altra caratteristica che spicca nella proteinasi K è la sua stabilità in presenza di alte temperature (50 - 60 ° C).
Attività enzimatica
La proteinasi K ha bisogno della presenza di ione calcio, anche se questo non influenza la sua attività, se è essenziale per mantenere la sua stabilità.
Perché la proteinasi K esegua la completa digestione del substrato, è necessario un tempo di contatto approssimativo tra 5 minuti e 2 ore.
Tuttavia, in questo senso Daza et al. Confrontò la purezza del DNA ottenuto in vari momenti di esposizione alla proteinasi K e concluse che una prolungata incubazione (fino a 24 ore) migliora significativamente la qualità del DNA.
Ora, in relazione alla concentrazione che viene utilizzata dall'enzima proteinasi K nei diversi protocolli, si può dire che è molto varia.
Può essere utilizzato da concentrazioni molto basse (5 μg / ml) a concentrazioni di 500 μg / ml. Ma le concentrazioni di lavoro più frequenti variano tra 50-100μg / ml, soprattutto per la digestione delle proteine e l'inattivazione della nucleasi. Sebbene sia richiesta una concentrazione di 2 mg / ml per il trattamento dei tessuti.
applicazioni
Le sue applicazioni sono molto ampie e possono essere riassunte come segue:
-È utilizzato nella digestione delle proteine e nell'estrazione del DNA con diversi metodi come: salatura, PK-SDS, cetil-trimetilammonio bromuro (CTAB), acetato di potassio modificato ed estrazione con ioduro di sodio.
-Inattivazione di nucleasi (RNasi e DNasi).
-Nella tecnica dell'ibridazione in situ (HIS), per aiutare il rilascio di acido nucleico, oltre ad eliminare le proteine indesiderate.
-Modifica delle proteine.
-Al livello della ricerca, in vari studi.
Vantaggi della proteinasi K
Diversi studi comparativi sono stati condotti tra le tecniche di estrazione del DNA usando Proteinase K, con altri che non lo usano e tutti concludono che ci sono maggiori benefici quando si usa l'enzima. Tra i vantaggi, possiamo menzionare quanto segue:
- Si ottiene DNA di alto peso molecolare, alta qualità e purezza.
-Il DNA estratto è stabile fino a 3 mesi.
Il DNA estratto può essere utilizzato nelle seguenti tecniche: Southern blot, polimerasi a catena (PCR), elettroforesi, tra gli altri.
Proteine resistenti alla proteinasi K
Diverse indagini hanno concluso che i prioni (proteine tossiche PrPSc anormali) sono differenziati dalle proteine PrPC (native) perché sono resistenti all'azione della proteinasi K, mentre i PrPC sono sensibili alla loro azione.
Altri autori hanno descritto che nella struttura di PrPSc ci sono porzioni sensibili e altre resistenti alla proteinasi K. Tuttavia, entrambe le parti sono ugualmente tossiche e infettive.
D'altra parte, Bastian e collaboratori nel 1987 hanno isolato 4 proteine di 28, 30, 66 e 76 kda da una specie di Spiroplasma mirum . Tutti erano resistenti all'azione della proteinasi K e hanno anche avuto reazioni crociate con alcuni prioni.
È noto che questa specie può causare cataratta e importanti danni neurologici e, a seguito delle scoperte scientifiche di Bastian, tra le altre indagini, è stato fatto un tentativo di mettere in relazione questo microrganismo con le encefalopatie spongiformi trasmissibili.
Tuttavia, l'eziologia di questa patologia neurologica degenerativa è ancora attribuita ai prioni.
In questo senso, Butler e collaboratori nel 1991 hanno identificato e caratterizzato una classe di proteine resistenti alla proteinasi da 40 Kda da due ceppi di Mycoplasma hyorhinis. Questo agente patogeno colpisce i maiali, infettando i loro tessuti, ma in questo caso non vi è stata alcuna reazione incrociata con i prioni testati.
Sono necessarie ulteriori ricerche per chiarire molte incognite a riguardo.
