Brodo malonato: fondazione, preparazione e usi

Il brodo malonato è il terreno di coltura liquido utilizzato per il test diagnostico (test del malonato), utilizzato per differenziare alcuni generi della famiglia delle Enterobacteriaceae. È stato creato da Leifson nel 1933 e successivamente modificato da Ewing, che ha aggiunto una piccola quantità di estratto di destrosio e lievito alla formula originale.

Il mezzo è attualmente composto da estratto di lievito, solfato di ammonio, fosfato dipotassico, fosfato monopotassico, cloruro di sodio, malonato di sodio, destrosio e blu di bromotimolo. Questo test è solitamente incluso nella batteria di identificazione biochimica per Enterobacteria, aiutando a differenziare determinati generi e specie.

Il test del malonato si basa principalmente sulla capacità di alcuni microrganismi di utilizzare il malonato di sodio come unica fonte di carbonio e solfato di ammonio come fonte di azoto.

Il test del malonato è generalmente positivo in alcune specie dei generi Enterobacter, Klebsiella e Citrobacter. Mentre, la maggior parte delle specie dei generi Escherichia, Salmonella, Shigella, Edwardsiella, Yersinia, Serratia, Morganella, Proteus e Providence, danno una reazione negativa.

fondazione

Il test del malonato consiste nel dimostrare quei batteri che sono in grado di usare il sodio malonato come unica fonte di carbonio e solfato di ammonio come fonte di azoto.

La maggior parte degli enterobatteri che non usano il malonato è in grado di crescere in questo terreno, assumendo come nutrienti il ​​destrosio e l'estratto di lievito.

In questo caso, qualsiasi tentativo di alcalinizzazione mediante l'uso dei peptoni verrà neutralizzato dalla produzione di acidi generati dalla fermentazione del destrosio. Allo stesso modo, il dipotassio e il fosfato monopotassico agiscono come un tampone mantenendo il pH a 6.7.

Ecco perché, quando il test è negativo, il brodo è dello stesso colore originale (verde). In rari casi il terreno potrebbe essere acidificato a causa della fermentazione del destrosio; senza l'uso dei peptones e l'indicatore di pH girerebbe il colore del mezzo verso il giallo. Perché ciò avvenga, il pH deve scendere a 6.

Ora, quando questo test è positivo, si dice che il microrganismo usava rispettivamente il solfato di ammonio e il malonato come fonti di carbonio e di azoto, senza fare uso degli altri componenti.

In questo caso, il mezzo diventa alcalino a causa del rilascio di sodio e della conseguente formazione di NaOH. In questo senso, l'indicatore di pH (blu di bromotimolo) trasforma il colore da verde a blu quando il pH è uguale o superiore a 7, 6. Il blu può essere chiaro o intenso (blu di Prussia).

Infine, il cloruro di sodio mantiene l'osmolarità del mezzo e l'acqua è il diluente di tutti i componenti.

interpretazione

Brodo dello stesso colore (verde): test negativo

Brodo giallo: test negativo

Brodo blu chiaro o intenso: prova positiva

Esiste una variante chiamata brodo di fenile fenilalanina, chiamato anche Shaw e Clarke medium. In questo caso, è possibile analizzare due test, l'uso di malonato come fonte di carbonio e la produzione di acido piruvico da fenilalanina.

preparazione

Brodo malonato

La quantità di grammi specificata dall'inserto della casa commerciale scelta viene pesata (può variare da uno all'altro). Grassi pesanti sono sospesi in un litro di acqua distillata. Scaldare leggermente fino a completa dissoluzione. Distribuire 3 ml di terreno in provette da 13/100 con un coperchio di cotone.

Sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 15 o 20 minuti.

Raffreddare prima dell'uso. Se non verranno utilizzati immediatamente, conservare in frigorifero fino al momento dell'uso. Temperare i brodi a temperatura ambiente prima di inocularli.

Il pH del terreno dovrebbe essere 6, 7 ± 0, 2. Il colore del mezzo preparato è verde bottiglia.

Brodo di fenonalanina malonato

Pesare 11 g del mezzo disidratato e sciogliere in 1 litro di acqua distillata. Il resto della preparazione è uguale a quello sopra descritto.

Può anche essere preparato aggiungendo 2 gr / L di fenilalanina al brodo di malonato prima di sterilizzarlo.

uso

È usato come parte della batteria di test biochimici che vengono assemblati per l'identificazione dei batteri della famiglia delle Enterobacteriaceae.

Aiuta a distinguere tra:

-Il genere Klebsiella e Enterobacter (+) del genere Escherichia e Serratia (-).

-Le specie di Salmonella enterica ssp arizonae, Salmonella enterica ssp salame e Salmonella enterica ssp diarizonae (+), della specie Salmonella enterica ssp enterica (-).

-Dal genere Klebsiella in genere (+) del genere Actinobacillus (-).

-Può talvolta aiutare la differenziazione di generi e specie di batteri non appartenenti alla famiglia delle Enterobacteriaceae, come tra i bacilli Gram negativi non fermentanti Alcaligenes faecalis (+) e Acinetobacter sp (-).

processo

Sotto un accendino, viene prelevata una porzione di una colonia pura, usando un manico in platino opportunamente sterilizzato e raffreddato. Il campione prelevato (inoculo leggero) viene dissolto nel brodo di malonato. Viene incubato con il coperchio libero in aerobiosi a 35 ° C ± 0, 2 per 24-48 ore.

Il brodo malonato può anche essere inoculato da una coltura di 18-24 ore in brodo di triptasi di soia. In questo caso si prelevano 0, 01 ml con una pipetta sterile e si inocula il brodo di malonato. Viene incubato con il coperchio libero in aerobiosi a 35 ° C ± 0, 2 per 24-48 ore.

Alla fine del tempo i risultati sono interpretati. Eventuali tracce di colore blu culminate dopo 48 ore di incubazione dovrebbero essere considerate positive. Il test non deve essere interpretato come negativo fino al completamento del tempo di incubazione di 48 ore.

Nel caso di utilizzo della variante di brodo di fenilalanina malonato, il malonato viene prima interpretato e quindi vengono aggiunte 5 gocce di 1N HCL e 3-5 gocce di cloruro ferrico 8%. Un colore verde scuro è interpretato come un test positivo per la fenilalanina. Se, d'altra parte, il mezzo diventa blu pallido, il test è negativo per la fenilalanina.

Controllo di qualità

Per eseguire il controllo della sterilità del terreno, uno o due brodi devono essere incubati a 35 ° C ± 0, 2 per 24 ore di incubazione. Alla fine di questo periodo non ci dovrebbero essere torbidità, nessun cambiamento di colore.

Per il controllo della qualità è possibile utilizzare ceppi noti o certificati, quali: Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Klebsiella pneumoniae ATCC 33945, Salmonella enterica ssp arizonae ATCC 13314 e Escherichia coli ATCC 25922.

I risultati attesi sono:

  • Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae e Salmonella enterica ssp arizonae danno una reazione positiva (colore blu medio).
  • Per Escherichia coli il risultato deve essere negativo, cioè si prevede che non vi sia alcun cambiamento nel colore (verde) o che diventi giallo a causa della fermentazione del glucosio.

limitazioni

Non usare brodo che mostri torbidità, precipitati, cambio di colore o qualsiasi segno di deterioramento.