Test della catalasi: fondotinta, tecnica e usi
Il test della catalasi è una metodologia utilizzata nei laboratori di batteriologia per dimostrare la presenza dell'enzima catalasi in quei batteri che lo possiedono. Insieme alla colorazione Gram sono i test principali che dovrebbero essere eseguiti su microrganismi appena isolati. Questi test guidano il microbiologo sui passi da seguire per l'identificazione definitiva del microrganismo in questione.
In generale, i batteri contenenti citocromo possiedono l'enzima catalasi, cioè i batteri anaerobici aerobici e facoltativi dovrebbero possederlo. Tuttavia, ci sono delle eccezioni, come lo streptococco, che nonostante siano microrganismi anaerobici facoltativi non possiedono l'enzima catalasi.
Questo è il motivo per cui il test della catalasi viene utilizzato principalmente per distinguere le famiglie Staphylococaceae e Micrococacee (entrambe catalasi positive) della famiglia Streptococaceae (catalasi negativa).
Allo stesso modo, il genere Bacillus (catalasi positivo) si distingue dal genere Clostridium (catalasi negativo), tra gli altri.
fondazione
La catalasi è un enzima classificato come idroperossidasi, questo significa che usano il perossido di idrogeno (H 2 O 2 ) come substrato.
È anche considerato un ossidoreduttasi, poiché nella reazione in cui vi è un elemento che funge da donatore di elettroni (sostanza riducente) e un altro da recettore di elettroni (sostanza ossidante).
La catalasi è una proteina che contiene un gruppo protesico con quattro atomi di ferro trivalente (Fe +++), quindi è un'omoproteina. Lo ione ferrico rimane ossidato durante la reazione.
Si può dire che la catalasi è un enzima disintossicante, poiché la sua funzione è quella di eliminare le sostanze prodotte durante il metabolismo batterico che sono tossiche per i batteri. Tra queste sostanze c'è il perossido di idrogeno.
Il perossido di idrogeno è formato dalla decomposizione degli zuccheri per via aerobica. Questo processo si verifica come segue:
Lo ione superossido (O 2 -) (radicale libero) si forma come prodotto finale dell'assimilazione del glucosio per via aerobica. Questo è tossico ed è eliminato dall'enzima superossido dismutasi che lo trasforma in ossigeno gassoso e perossido di idrogeno.
Il perossido di idrogeno è anche tossico per i batteri e dovrebbe essere eliminato. L'enzima catalasi spiega il perossido di idrogeno in acqua e ossigeno.
La catalasi può agire su substrati diversi dal perossido di idrogeno, come alcoli, aldeidi, acidi, ammine aromatiche e fenoli. Tuttavia, il catalizzatore può anche utilizzare il perossido di idrogeno per ossidare altri composti tossici come il metilico e l'alcol etilico.
Allo stesso modo, la catalasi è presente nelle cellule fagocitiche, proteggendola dall'azione tossica del perossido di idrogeno.
Tecnica di routine per il test della catalasi
-Oggetto degli oggetti
materiale
Perossido di idrogeno al 3% (10 volumi).
Far scorrere il vetro
Manico in plastica monouso o bastone di legno.
processo
Prendi abbastanza della colonia per studiare senza toccare l'agar da dove viene. La colonia deve essere fresca, cioè da una coltura di 18-24 ore.
Posizionare la colonia sul vetrino asciutto e aggiungere una goccia di perossido di idrogeno al 3% (si può usare anche il 30% di H 2 O 2 ). Osservare immediatamente se le bolle sono rilasciate o meno.
interpretazione
Reazione positiva: evoluzione del gas, che è evidenziata dalla formazione di bolle (forte gorgogliamento).
Reazione negativa: non c'è formazione di bolle.
- Metodo diretto in pura cultura
Mettere 1 ml di 3% di H 2 O 2 su una coltura pura in piastre o cunei che non contengano sangue (preferibilmente agar nutritivo). Osservare se la formazione di bolle esiste immediatamente. Puoi anche usare H 2 O 2 al 30%.
Viene interpretato allo stesso modo del metodo di porting dell'oggetto.
-Metodo con tubo capillare o Fung e Petrishko
Riempire un capillare da 67 mm ad un'altezza di 20 mm con perossido di idrogeno al 3% per capillarità.
Tocca la colonia isolata che desideri studiare con il capillare riempito con il 3% di H 2 O 2 . Osservare se il capillare è riempito di bolle in circa 10 secondi. Questo metodo consente di semi-quantificare la reazione in incroci:
Senza incroci non ci sono bolle (reazione negativa).
+ ---- Piccole bolle (reazione debole o ritardata).
++ Bolle abbondanti (reazione moderata).
+++ - Le bolle raggiungono l'estremo opposto (reazione energetica).
-Metodo Taylor e Achanzar per test di catalasi che danno dubbi
Su una diapositiva pulita e asciutta, posizionare una colonia isolata, quindi inserire una goccia di 0, 5% di H 2 O 2 e coprire con un vetrino coprioggetti. Osservare se ci sia o meno formazione di bolle intrappolate.
Interpretazione: la presenza di bolle indica una reazione positiva. Senza bolle, è interpretato come una reazione negativa.
Test di catalasi per specie Mycobacterium
Questa tecnica deve essere eseguita controllando il pH e la temperatura. Deve essere eseguito sotto una cappa a flusso laminare, poiché la manipolazione delle diverse specie di Mycobacterium è pericolosa.
-Materiali
Perossido di idrogeno al 30% o 110 volumi (superossido).
PH 7 tampone fosfato
10% Tween 80
Coltivazione del cuneo Mycobacterium da 3 a 4 settimane
-Preparazione dei reagenti
PH 7 tampone fosfato
rammarico:
1.361 g di fosfato monopotassico anidro (KH 2 PO 4 ).
1, 420 g di fosfato di sodio anidro (Na2HPO3).
Sciogliere entrambi i sali in poca acqua distillata sterile e completare con acqua fino a 1000 ml.
10% Tween 80
Fai una diluizione 1:10 al Tween 80 che viene commercialmente concentrato, quindi procedi come segue:
Prendere 1 ml di Tween 80 e metterlo in poca acqua distillata, sciogliere e completare il volume con acqua a 10 ml.
Reagente finale
Mescolare una quantità di tampone fosfato con una quantità di Tween 80 al 10% (in parti uguali). Definisci in laboratorio quanto vuoi preparare.
procedura -a
Mettere 5 ml di tampone fosfato in una provetta sterile con tappo a vite (bachelite).
Con un cappio di inoculazione, prendi una colonia sufficiente di una crescita di Mycobacterium seminato a spicchi e sciogli nel tampone fosfato.
Coprire il tubo senza stringere troppo il filo. Mettere a bagnomaria a 68 ° C per 20-30 minuti. Rimuovere e lasciare raffreddare a 22-25 ° C
Misurare 0, 5 ml del reagente finale (miscela) e aggiungerlo al tubo con la soluzione fredda. Osservare la formazione o meno di bolle.
È interpretato come le tecniche precedenti.
uso
Quando si ottiene una crescita delle colonie in terreni arricchiti, è necessario eseguire una colorazione di Gram e un test di catalasi sulle colonie ottenute. Questo guiderà il microbiologo sulle procedure da seguire per l'identificazione definitiva.
Controllo di qualità
Per valutare il corretto funzionamento del reagente del perossido di idrogeno, utilizzare ceppi di controllo appena colti, come lo Staphylococcus aureus come controllo positivo e ceppi di Streptococcus sp come controllo negativo.
Un'altra alternativa che funge da controllo positivo è quella di posizionare una goccia di perossido di idrogeno sull'agar sangue, gli eritrociti hanno catalasi, quindi, se il reagente è in buone condizioni, ci sarà un gorgoglio.
Un agar cioccolato può essere usato come controllo negativo, qui gli eritrociti sono già lisati e il test è negativo.
limitazioni
-Non utilizzare vecchie culture per il test, in quanto ciò potrebbe causare falsi negativi.
-Evitare di prelevare colonie da colture su agar sangue, se si presta attenzione a non toccare l'agar; questa procedura può causare falsi positivi, poiché gli eritrociti contengono catalasi.
-Se si prende la colonia con manico in platino, non invertire l'ordine della procedura perché questo può generare falsi positivi. Questo perché il platino è in grado di reagire con il perossido di idrogeno, causando un gorgoglio.
-Non usare il reagente a base di perossido di idrogeno se è troppo vecchio, poiché il reagente è molto instabile e tende a decomporsi nel tempo.
-Tenere il reattivo di perossido di idrogeno protetto dalla luce e in frigorifero per evitare danni.
- Effettuare un controllo di qualità del reagente del perossido di idrogeno ogni volta che viene utilizzato.
- Considerare che se H 2 O 2 viene utilizzato al 30%, le reazioni sono più forti di quelle prodotte con il 3% di H 2 O 2 .
